Бюллетень
Викторина
Глава
Диплом
Доклад
Методическая разработка по теме: «Питательные среды»
 Скачать 404.39 Kb.
|
1 2
| БОУ РК «КАЛМЫЦКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ ИМ. Т. ХАХЛЫНОВОЙ» Методическая разработка по теме: «Питательные среды» Элиста, 2014 г. Пояснительная записка Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микроорганизмов. Питательные среды – это субстраты, используемые для выращивания микроорганизмов в лабораториях или в производственных условиях, их используют для выделения чистых культур микроорганизмов, определения культуральных и биохимических свойств, накопления биомассы. Цели: ОК. 2; 4; 6; 8; 9; 13, ПК. 4.1-4.4 1. Учебная: получить знания о типах питания микробной клетки, определения и назначения питательных сред, требования, классификация, этапы приготовления, значение лабораторной посуды для приготовления среды, хранение, контроль качества. 2. Развивающая: развить умения при подготовке питательных сред, определение рН методом Михаэлиса и индикаторными полосками. 3. Воспитательная: приучить к аккуратной работе самостоятельно с соблюдением ТБ при эксплуатации электрических приборов. После изучения темы студент должен: Знать:
Уметь:
Содержание Стр. 1. Учебная карта работы преподавателя и студента на занятии………………4 2. Общая характеристика питательных сред……………………………………5 3. Классификация питательных сред по физическому состоянию……………6 4. Классификация питательных сред по составу……………………………….6 5. Классификация питательных сред по назначению…………………………..7 6. Требования, предъявляемые к питательным средам………………………...7 7. Универсальные плотные питательные среды………………………………..9 8. Универсальные жидкие питательные среды……………………………….10 9. Элективные питательные среды……………………………………………..12 10. Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды…………….20 11. Консервирующие (транспортные) питательные среды…………………..25 12. Тестовый контроль для закрепления материала…………………………..26 13. Индивидуальные дидактические карточки………………………………..33 14. Расчетные задачи……………………………………………………………35 15. Список используемых источников………………………………………...36 Учебная карта работы преподавателя и студента на занятии
Общая характеристика питательных сред Питательная среда должна содержать все вещества необходимые для роста микроорганизмов. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Следует отметить, что универсальных сред одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует. Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред. По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две группы – автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту – соединение, содержащее углерод в наиболее окисленной форме для этого в среду вносят бикарбонат натрия (NaHCO3) или карбонаты – углекислый кальций (CaCO3). Для гетеротрофов среда должна содержать органическое соединение, такие как кислоты, спирты, углеводы, ароматические соединения. Вторым основным компонентом питательной среды является источник азота, который входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме – в виде амино (-NH2) или имино (-NH) групп. Питательные среды для культивирования микроорганизмов, более требовательных к азоту и соответственно обладающих меньшими биосинтетическими способностями, должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот, таких как глицин, аланин, пролин, лизин. Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления – пептоны. Это смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований. Некоторые бактерии способны использовать в качестве единственного источника азота молекулярный азот – N2 (азотофиксаторы). Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, аминокислоты. Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроорганизмам для построения веществ клетки необходимы сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Классификация питательных сред по физическому состоянию: 1. Жидкие – широко применяются для накопления биомассы или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии микроорганизмов, а также для поддержания и сохранения в коллекции культур микроорганизмов плохо развивающихся на плотных средах. 2. Сыпучие – применяются в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов (разваренное пшено, отруби, кварцевый песок пропитанный питательным раствором. 3. Плотные – используются для выделения чистых культур в диагностических целях для описания колоний для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекциях. Плотной основой служит агар или желатин. 4. Полужидкие – среда Пешкова для изучения характера подвижности колоний микроорганизмов. Классификация питательных сред по составу: 1. Натуральные (Естественные) – МПБ, солодовое сусло, дрожжевая среда, картофельная среда, почвенный экстракт – состоят из продуктов животного или растительного происхождения (овощные или фруктовые соки, животные ткани, молоко, мясо, кровь, почва) на натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты необходимые для роста и развития, но есть и минусы. Имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, их используют в основном для поддержания роста культур микроорганизмов. 2. Синтетические – в состав среды входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Синтетические среды широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов для роста или усиления биосинтеза какого-либо продукта жизнедеятельности. 3. Полусинтетические – главным компонентом этих сред являются соединения известного химического состава – углеводы, соли аммония, нитраты, фосфаты. Однако в их состав всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизат казеина, их используют в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков Классификация питательных сред по назначению: 1. Универсальные (пептонная вода, МПА, МПБ) – подходят для культивирования большинства микроорганизмов. 2. Элективные (кровяной агар, желточно-солевой агар, крахмальная среда, Китта-Тароцци, Эшби) – предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания, обеспечивают развитие определенной группы бактерий, для которой характерна общность физиологических свойств. 3. Дифференциально-диагностические – индикаторные (ЭНДО, Плоскирева, Клиглера), среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Пример: на среде ЭНДО колонии E.coli образуют малиновые колонии с металлическим блеском (лактоза + ) или без него (лактоза – ). 4. Консервирующие (глицериновая смесь) предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала, в них предотвращается гибель патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Требования, предъявляемые к питательным средам: 1. Питательными – содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей бактерий. 2. оптимальное рН – концентрация водородных ионов, только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Норма (рН 7,2-7,4) исключение холерный вибрион (рН 8,5-9,0) и возбудитель туберкулеза (рН 6,2-6,8), продукты жизнедеятельности бактерий могут изменять рН поэтому необходимо добавлять вещества которые будут их нейтрализовать (буферность). 3. Изотоничность – осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки в норме соответствует 0,5% раствору натрия хлорида. 4. Стерильность – посторонние микроорганизмы препятствуют росту исследуемой культуры. 5. Влажность – характерно для плотных питательных сред. 6. Окислительно-восстановительный потенциал – соотношение веществ отдающих и принимающих электроны, этот потенциал (RH2) показывает насыщение среды кислородом. Пример: анаэробы размножаются при (RH2) не выше 5, а аэробы – при (RH2) не ниже 10. 7. Прозрачность – удобно наблюдать за ростом микроорганизмов. Универсальные плотные питательные среды Мясо-пептонный агар (МПА) - плотная или полужидкая универсальная питательная среда, состоящая из мясо-пептонного бульона с добавлением 0,5—2% агара и применяемая для выращивания большинства патогенных микроорганизмов. Основой для приготовления МПА является мясная вода, к которой прибавляют 1% порошкообразного пептона и 0,5% поваренной соли и растворяют при подогревании. Для полного осаждения белков жидкость кипятят, постоянно помешивая, в течение 30 мин. или выдерживают 20 мин. в автоклаве при t115°С. После этого фильтруют через 3—4 слоя фильтровальной бумаги, предварительно смоченной дистиллированной водой, устанавливают реакцию среды (рН не ниже 8,2—8,4) и добавляют 0,5—2% (в зависимости от необходимой степени плотности среды) размельченного и промытого агара, после чего жидкость нагревают, медленно помешивая, до полного растворения агара. При упаривании добавляют горячую дистиллированную воду до первоначального объема. После растворения агара проверяют реакцию среды, окончательно устанавливают требуемую величину рН (обычно 7,2—7,3) и, если необходимо, фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат разливают в пробирки, флаконы, колбы и стерилизуют в автоклаве при t120°С в течение 20—30 мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется. Источником азота являются органические соединения, находящиеся в мясной воде, и некоторые продукты протеолиза белков — пептоны, представляющие собой смесь полипептидов (зачастую довольно сложных), дипептидов различных аминокислот. МПА содержит 0,4% общего азота, 0,07% аминного азота, 4,6% сухого остатка, 1,4% зольных элементов и 0,85% хлоридов. При остывании агаризованной среды образуется конденсационная вода, для получения изолированных колоний чашки Петри помещают в термостат крышками вниз. В противном случае на внутренней стороне крышки скапливается конденсат, который стекая на поверхность среды мешает получению изолированных колоний. МПА с добавлением определенных компонентов (крови, сыворотки, яичного желтка и т. п.) употребляется для культивирования некоторых патогенных микроорганизмов, плохо растущих или совсем не растущих на обычных питательных средах. Мясо-пептонная желатина (МПЖ) – этот экстракт получают из субстратов богатых коллагеном – белком костей, хрящей, чешуи. Образуемый желатинной гель плавится при температуре 250С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (370С). Кроме того желатина разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатины ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатину используют в диагностических целях – для выявления протеолитической активности, а также для получения глубинных колоний дрожжей. К жидким средам добавляют 10-20% желатины, оставляют набухать 5-10 мин. И нагревают на водяной бане до растворения. Доводят рН среды до 6,8-7,0. Желатина имеет кислую реакцию и обладает большой буферностью, на нейтрализацию идет больше щелочи, чем на МПА. Желатиновые среды стерилизуют при 0,5 А 15 мин или дробно 3 раза по 20 мин. в аппарате Коха. Повторная стерилизация желатиновых сред особенно при рН ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, так как желатина частично гидролизуется и теряет гелеобразующие свойства. Универсальные жидкие питательные среды Мясо-пептонный бульон (МПБ) – сухой порошок, состоящий из гидролизата мяса и НаСи. 500 г мяса освобожденного от костей заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 часов или в термостат при 300С на 6 часов. За это время из мяса эстрагируются различные вещества, в том числе водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объема. К мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% НаСи. Среду стерилизуют при 1А. Солодовое (неохмельненное пивное) сусло – хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий. Основные компоненты сусла – углеводы (до 90% от общей массы сухого остатка) и азотсодержащие соединения (до 6-7% от общей массы сухого остатка). Из углеводов в наибольшем количестве содержится мальтоза и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимущественно группы В, органические кислоты и минеральные соли. Сусло готовят следующим образом. 250 г. размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48-500С и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру поднимают до 55-580С и поддерживают на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т.е. до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит так же гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через бумажный диск. В фильтрате определяют концентрацию сахара, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в сусле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаще всего используют 3-4 Б, для дрожжей 6-8 Б, для молочнокислых бактерий 8-12 Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 А 30 мин. Дрожжевая среда – используется для культивирования ряда гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды – дрожжевая вода. Для ее приготовления необходимо 70-100 г свежих прессованных или 7-10 г сухих дожей 30 мин кипятят в 1 л воды и после осаждения клеток фильтрую через фильтр. К фильтрату добавляют 1 л воды еще раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожжевой воды добавляют 1-2 г углеводов и минеральные соли, чаще всего К2РО4 (0,1 г) и NaCl (10,5 г). Доводят рН среды до 6,8-7,2. Среду стерилизуют при 0,5 А 20-30 мин. Картофельная среда – используется в основном для культивирования спорообразующих бактерий, представителей рода Caulobacter и некоторых других хемоорганотрофных бактерий. Для приготовления этой среды понадобится 200 г тщательно вымытого и очищенного от кожуры и глазков картофеля нарезают мелкими ломтиками, заливают 1 л воды и кипятят 20-30 мин. Отвар фильтруют через вату, доводят объем фильтрата до 1 л и разливают в сосуды для культивирования. Среду стерилизуют 1 ч при 1 А или 30 мин при 1,5 А. Почвенный экстракт – используют главным образом для культивирования разнообразных представителей почвенной микрофлоры. Для его приготовления понадобится 500 г плодородной почвы, которую заливают 1,5 л воды и автоклавируют при 1 А 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр, добавляют к горячему фильтру 0,5 г СаСО3 тщательно перемешивают и через 5-7 мин фильтруют вновь. К экстракту еще добавляют 0,2 г К2НРО4 на каждые 1000 мл. Стерилизуют при 1 А. Элективные питательные среды Для культивирования стафилококков. Молочно-солевой агар – к 100 мл МПБ добавляют 6,5 г NaCL, 20 г агара. Стерилизуют 1 А, добавить 10% стерильного обезжиренного молока (1,6%). Желточно-солевой агар (агар Чистовича) – селективная среда, предназначенная для культивирования стафилококков. Содержит питательный агар, желток куриного яйца, повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые не препятствуют размножению стафилококков и обеспечивают элективность среды для данных микробов. Среда позволяет дифференцировать лецитиназопозитивные стафилококки, вокруг колоний, которых образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком. К МПА добавляют 10% NaCl. Стерилизуют 1 А, добавить 20% желточной эмульсии и 1,5% агара. Приготовление желточной взвеси – яйцо моют с мылом, протирают спиртом. Отделяют стерильным скальпелем желток и эмульгируют в 200 мл стерильного физиологического раствора. Не стерилизуют. Кровяной агар – питательная среда для выявления гемолитических свойств бактерий. К расплавленному остуженному (до 45-500С) питательному агару асептически добавляют 5-10% дефибринированной крови, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки Петри. Вокруг выросших колоний отчетливо видны прозрачные зоны гемолиза. Для культивирования стрептококков. К стерильному МПА в количестве 1 л добавляют 7% крови, 7,5 мг налидиксовой кислоты, 17 тыс ЕД полимиксина В, 2,12 немицина. Каждый антибиотик растворяют в 20 мл стерильной воды и добавляют раствор в питательную среду. Для культивирования клостридий – анаэробов. Среда Кита-Тароцци – обеспечивает рост многих спорообразующих и строгих аспорогенных анаэробов. Ее используют для культивирования и хранения клостридий. Состоит из питательного бульона, 2% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла. Выросшие анаэробы вызывают помутнение питательной среды. 100 г говяжьей печени нарезают и заливают 300 мл МПБ, кипятить 30 мин. Фильтрация. Печень промыть водой и поместить 3-4 кусочка печени в каждую пробирку добавить 8 мл МПБ. Стерилизуют и перед посевом кипятят, в конце заливают вазелиновым маслом. Среда Вильсона-Блэра (ЖЕЛЕЗО-СУЛЬФИТНЫЙ АГАР) используется для выделения анаэробных бактерий. Готовится из питательного агара, к которому добавляют 1% глюкозы, хлорид железа и сульфит натрия. Анаэробные клостридии (Clostridium perfringens) образуют на среде колонии черного цвета за счет образования соединений железа с серой. К 100 мл стерильного расплавленного и охлажденного до 80°С щелочного 3% МПА доливают 10 мл 20% свежеприготовленного стерильного (1 ч в текучем паре) раствора натрия сульфита и 1 мл 8% раствора железа хлорида, приготовленного на стерильной воде. Среду разливают в пробирки высоким столбиком и без стерилизации ставят в термостат при 37°С на сутки для проверки стерильности. Материал засевают уколом в столбик или в расплавленную и охлажденную среду. Патогенные и условно-патогенные анаэробы образуют в среде колонии черного цвета или дают сплошное почернение среды. Для культивирования актиномицет. Крахмальная среда – к 20 г крахмала добавить К2НРО4 0,5 г, KNO3 1 г, MgSO4 0,5 г, Na 0,5 г, FeSO4 0,01 г, Н2О 1 л. Для культивирования псевдомонад. Среда Кинга – к 20 г пептона добавить 10 г глицерина, К2 SO4 10 г, MgCL2 1,4 г, агар 20 г, Н2О 1 л. Для культивирования энтеробактерий. Среда Эндо – предназначена для выделения энтеробактерий, обнаружения эшерихий. Состоит из питательного агара, 1% лактозы и индикатора – основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском, лактозоотрицательные кишечные палочки образуют бесцветные колонии. Контроль качества: колонии патогенных бактерий должны быть бесцветны, колонии E.coli – красные. Качество среды можно проверить пробой Скородумова на альдегид. На поверхность среды пинцетом помещают кружок фильтровальной бумаги с 2% раствором формалина. При хорошем качестве среды вокруг кружка, через 10 мин. появляется окрашенная зона в 2 мм. Имеющая металлический оттенок. Если кольцо не выражено, то среда пригодна к употреблению. Среда Левина – среда предназначена для родовой идентификации энтеробактерий по способности утилизировать ацетат натрия; применяется для контроля пищевых продуктов при подозрении на присутствие в них шигелл. Для культивирования сальмонелл. Висмут-сульфит агар (ВСА) – селективная среда для выделения сальмонелл. Готовая среда непрозрачна, зеленоватого цвета. Содержит глюкозу, неорганические соли, бриллиантовый зеленый, питательный агар. Бриллиантовый зеленый и висмут подавляют рост грамположительной флоры и многих энтеробактерий, в том числе шигелл, эшерихий. Сальмонеллы при росте на среде выделяют сероводород, который взаимодействует с солями висмута. В результате образуются колонии черного цвета с металлическим оттенком на зеленоватом фоне среды. Контроль качества: при наличии роста Salmonell из разведений 10-7-10-8 и при отсутствии роста E.coli из этих же разведений оценивается качество выросших колоний их размер и характер окраски. Для культивирования азотофиксаторов. Среда Эшби – к 20 г глюкозы добавляют К2НРО4 0,2 г, MgSO4 0,2 г, NaCl 0,2 г, К2SO4 0,2 г, СаСО3 5 г, 2% агара, Н2О 1 л. Для предупреждения роста грибов после стерилизации добавляют нистатин 1 таблетка на 200 мл среды. Для культивирования грибов. Среда Сабуро – к 4 г глюкозы добавляют 1 г пептона, 2 г агар, Н2О 100 мл. Среда Чапика – к 30 г глюкозы добавляют 2 г НаНО3, 1 г КН2РО4, 0,5 г MgSO4, 0,5 г KCL, 0,01 г FeSO4, 4% агара, 100 мл Н2О. Для культивирования молочнокислых бактерий. Томатно-дрожжевая среда – к 40% томатного сока добавить 0,5% дрожжевого экстракта, 0,05% крахмала, 1% пептона, 0,1% твин-80, 1% уксуснокислого Na, 0,5% глюкозы. Приготовление соли А – К2НРО4 10 г, КН2РO4 10 г, 100 мл Н2О смешать компоненты и добавить в среду 0,5%. Приготовление соли В – MgSO4×7Н2О 11,5 г, MnSO4×4Н2О 2,86 г, FeSO4*7Н2О 0,68 г 100 мл Н2О, отбирают из смеси 0,5% и добавляют в среду. Все смешивают с 3% агаром. Стерилизация 0,5 А. Для культивирования микобактерий. Среда Левенштейна-Йенсена – плотная питательная среда для выделения и культивирования микобактерий, содержащая глицерин, аспарагин, органические и неорганические соли, малахитовый зеленый, картофель и куриные яйца. Размешать 37,24 г порошка в 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина (для некоторых видов микобактерий глицерин не добавлять). Прокипятить до полного растворения компонентов среды. Стерилизовать автоклавированием при 1А (1200С) в течение 15 мин. Приготовить стерильно 1000 мл эмульсии яиц. Асептически смешать 600 мл основы среды и 1000 мл яичной эмульсии до однородного состояния. Внести добавку Графта (Gruft Micobacterial Supplement FD053), если это необходимо. Разлить по пробиркам. Поместить пробирки в наклонном положении для формирования скошенной среды и прогревать (для коагуляции) при 8500С в течение 45 мин. Принцип и оценка результата: Оригинальная пропись Левенштейна была модифицирована Йенсеном, а Графт изменил среду добавлением двух антимикробных агентов. Среда, приготовленная на яичной основе, поддерживает рост различных видов микобактерий. Малахитовый зеленый, бензилпенициллин и налидиксовая кислота предотвращают рост большинства представителей сопутствующей флоры, в первую очередь той флоры, которая дает рост много раньше, чем микобактерии. РНК действует как стимулятор роста и позволяет повысить уровень высеваемости. Если могут быть выделены культуры бычьего или других глицерофобных видов микобактерий, глицерин добавлять не нужно. Малахитовый зеленый является не только ингибитором роста, но и pH-индикатором. Появление синих зон указывает на повышение кислотности за счет роста грамположительных контаминантов (например, Streptococcus spp.), желтые зоны выявляют контаминацию грамотрицательными бациллами. Протеолитические микроорганизмы формируют локальные зоны или полную деструкцию среды. Среда Левенштейна–Йенсена в модификации Графта рекомендуется для выделения и культивирования штаммов Nocardia из мокроты, промывных вод желудка и другого клинического материала. Харди с соавт. рекомендуют инокулировать и инкубировать каждую пробу в трех экземплярах: а) для обнаружения сапрофитов – при комнатной температуре (2500С); б) для оценки пигментации фотохромогенных и скотохромогенных микобактерий — при 3500С (на свету и в темноте). Наилучшие условия роста достигаются при 3500С в атмосфере 5–10 % углекислого газа. Контроль качества: внешний вид порошка – гомогенный сыпучий порошок зеленовато-синего цвета. Цвет и прозрачность готовой среды – готовая среда имеет светлый голубовато-зеленый цвет с гладкой, слегка опалесцирующей поверхностью. среда Пизу - питательная среда идентификации коринебактерий по типу расщепления цистина. Предназначена для видовой индетификации коринебактерий при расщеплении цистина ферментов цистиназы образует в этот момент сероводород H2S вступает в реакцию с висмутом соединение темно-коричневого цвета. Представляет собой мелкодисперсный порошок светло-желтого цвета, гигроскопичен, светочувствителен, готовят по этикетке, не стерилизуют, используют в течение 10 дней 2-80C. Разливают в пробирки, производят посев уколом бактериальной петлёй температура 370С 18-20 часов. Почернение среды по уколу и образования облачка черного цвета в глубине указывают на наличие фермента цистиназы полученный результат. Коринетоксагар - питательная среда для определения токсигенности дифтерийных микроорганизмов сухая. Сухой мелкодисперсный порошок светло-желтого цвета питательную среду в количестве указанном на этикетке раствор в 1литре H2O кипятить 3 мин, разливают во флаконы автоклавируют 1100С 30мин. После охлаждают добавляют 20% крови лошадиной, разводят в стерильной чашке Петри, среда прозрачная, желтая, хранится 14 суток t = 2-80C. Размер фильтровальных полосок от 80×15 мм. Стерилизуют и помещают в стерильную чашку и смачивают дифтерийным анатоксином, который предварительно разведен в 1 мл дис. воды. Смоченные бумажки переносят пинцетом на поверхность питательной среды подсушивают в термостате t =370 20 мин. Рост токсигенных коринебактерий сопровождается образованием линий преципитации. Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды Агар Плоскирева – дифференциально-диагностическая и селективная, способствует лучшему росту некоторых бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерий) и подавляет рост других (кишечная палочка и пр.). Содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Лактозонегативные колонии вырастают бесцветными, лактозопозитивные – красными. На некоторых модификациях среды Плоскирева выявляется еще и способность сальмонелл выделять сероводород: выросшие колонии чернеют. Контроль качества: 1. Через 24 часа на чашках должно вырасти а) из 100 микробных клеток патогенных культур не меньше 20 колоний б) из 100 тыс. клеток E.coli не больше 10 тыс. Из 10 тыс. клеток E.coli не больше 1000 колоний. в) из смеси 100 клеток патогенных культур и 100 тыс. E.coli – при наличии обильного роста колоний E.coli патогенные микробы должны легко выделятся и дифференцироваться. г) из смеси 100 клеток патогенных культур с 10 тыс. клеток E.coli – должны легко выделятся и дифференцироваться колонии патогенных микроорганизмов. 2.Патогенные микроорганизмы должны расти в виде бесцветных сочных колоний в S-форме. Колонии E.coli должны быть брусничного цвета. Среды Гисса – среды с углеводами и индикатором, используемые для определения сахаролитических свойств микробов в процессе их идентификации. Сухие коммерческие среды содержат углевод (глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, мальтозу и др.), индикатор ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты), питательный агар и соли минеральные. Для приготовления сред Гисса полужидких 20 г сухого порошка растворяют в 1 л дистил. воды при подогревании, доводят раствор до кипения, разливают в пробирки по 3 - 4 мл и автоклавируют 30 мин при 112°С. Правильно приготовленная среда должна иметь зелено-голубой цвет и не прорастать в течение суточной инкубации в термостате при 37°С. Иссл. культуру засевают уколом петли в столбик среды, инкубируют в термостате при 37°С сутки или более в зависимости от идентифицируемого вида. Перекрашивание среды в желтый цвет указывает на ферментацию сахара с образованием кислоты; такое же перекрашивание среды и появление в ее толще пузырьков – на ферментацию сахара с выделением кислоты и газа. При отсутствии ферментативной активности у микроба среда мутнеет, но цвета не меняет. Жидкие среды Гисса готовят на 1% пептонной воде, рН 7,4, с 0,5-1% концентрацией углевода и индикатором Андраде или бромтимоловым синим. В пробирки со средой опускают поплавки. Среду стерилизуют в автоклаве при 112°С в течение 30 мин. Образование кислоты регистрируют по изменению цвета среды (соответственно в розовый и желтый), образование газа по накоплению его в поплавках Начальный и при отсутствии ферментации цвет среды – соломенно-желтый с индикатором Андраде и желто-зеленый с индикатором бромтимоловым синим. Трехсахарный агар (среда Олькеницкого) предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности сбраживать углеводы в присутствии индикатора. Рост на трехсахарном железосодержащем агаре: 1. Контроль (незасеянная среда) 2. Salmonella серовара Typhimurium 3. Escherichia coli 4. Shigella flexneri 5. Salmonella серовара Typhi Пептический перевар животной ткани, гидролизат казеина, дрожжевой и мясной экстракты являются источником азотистых веществ, серы, микроэлементов, витаминов группы В и др. Лактоза, сахароза и глюкоза – ферментируемые субстраты. Тиосульфат натрия в сочетании с ионами железа являются индикатором на сероводород, феноловый красный – индикатор рН. Микроорганизмы, ферментирующие глюкозу, способствуют образованию многих кислот, изменяющих цвет среды с красного на желтый. Большее количество кислот освобождается в столбике (при ферментации), по сравнению со скошенной частью (окисление). Бактерии образуют также щелочные продукты (в ходе окислительного декарбоксилирования пептона). Принципиальное значение имеет соотношение глюкоза/лактоза (сахароза) = 1:10. Индикатор феноловый красный становится желтым при значениях рН менее 6,8. При исходном значении рН=7,4 требуется относительно небольшое количество кислот для развития желтого окрашивания среды. Щелочные продукты могут нейтрализовать небольшое количество кислоты, образуемое в скошенной части при ферментации глюкозы. Таким образом, щелочной (красный) скос и кислый (желтый) столбик указывают, что микроорганизм ферментирует глюкозу, но не ферментирует лактозу и/или сахарозу. Бактерии, ферментирующие помимо глюкозы лактозу и/или сахарозу, образуют большое количество кислот, которое не может быть нейтрализовано аминами, поэтому скос и столбик будут кислыми (желтыми). Если в ходе ферментации образуется газ, его можно определить по пузырькам и характерным разрывам среды. Некоторые виды бактерий восстанавливают тиосульфат до сероводорода, который, взаимодействуя с ионами железа, образует нерастворимый черный преципитат сульфида железа. Восстановление тиосульфата происходит только в кислой среде и почернение обычно бывает в зоне столбика. Среда Пешкова – дифференциально-диагностическая полужидкая питательная среда для определения у микроорганизмов подвижности и способности сбраживать глюкозу; содержит агар, глюкозу и индикатор бромтимоловый синий. Среда Симмонса - питательная среда, применяемая для определения способности бактерий использовать в качестве единственного источника углерода цитраты. Готовят добавлением к среде Козера 0,02% магния сульфата, 0,3% нейтрального цитрата натрия, 2% агара. После растворения агара устанавливают рН 7,2 и прибавляют 10 мл на 1 л 15% спиртового раствора бромтимолового синего. Среду фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют 15 мин при 120°С, скашивают. Иссл. Культуру засевают штрихом по поверхности. Ассимилирующие цитраты дают рост и изменяют цвет среды на синий, не ассимилирующие цитрат – не дают роста и не меняют цвета среды. Среда Клиглера – эту среду в качестве дифференциальной рекомендуют для изучения у грамотрицательных бактерий кишечного происхождения способности ферментировать глюкозу и лактозу, а также продуцировать сероводород. Размешать 57,5 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Тщательно перемешать и разлить в пробирки. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 А (121°С) в течение 15 мин. Остудить пробирки в таком положении, чтобы получить скошенную часть и столбик высотой 2,5 см. Наилучшие результаты получают на свежеприготовленной среде. Не рекомендуется применять пробирки с завинчивающимися крышками и флаконы. Принцип и оценка результата: Клиглер разработал среду для дифференциации бактерий тифо-паратифозной группы. Затем он провел оценку этой среды в сочетании с двойной средой Ресселя. Bailay и Lacey предложили заменить индикатор Андреде на феноловый красный, что позволяет дифференцировать грамотрицательные бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу и продуцировать сероводород. На агаре Клиглера можно отличать бактерии, ферментирующие и не ферментирующие лактозу, Salmonella typhi от других сальмонелл, а также Salmonella paratyphi А от Salmonella schottmuelleri и Salmonella enteritidis. Тиосульфат натрия и сульфат железа усиливают образование сероводорода. Феноловый красный – индикатор рН. О ферментации глюкозы свидетельствует желтый столбик, лактозы – желтый скос, об образовании сероводорода – почернение столбика. На агар Клиглера для предварительной идентификации засевают чистые культуры с чашечных сред, например, Агара МакКонки (М082), Висмут-сульфитного агара (М027) или Дезоксихолат-цитратного агара (М065), Агара Сальмонелла-Шигелла (М108). Контроль качества: Внешний вид порошка: Гомогенный сыпучий светло-розовый порошок. Консервирующие (транспортные) питательные среды Консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. В них предотвращается гибель патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. В качестве примера можно использовать глицериновую смесь, используемую для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения некоторых видов бактерий. Магниевая среда – среда содержит хлорид магния; она предназначена для накопления и выделения патогенных энтеробактерий при санитарных исследованиях продуктов питания, сырья и объектов внешней среды. Селенитовый бульон – среда предназначена для накопления и выделения бактерий рода Salmonella при санитарных исследованиях продуктов питания, сырья и объектов внешней среды. Тестовый контроль для закрепления материала |
1 2